关于发布《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》的通告（2020年第4号）

2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点

一、适用范围

2019新型冠状病毒核酸检测试剂用于对咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物等样本中的2019新型冠状病毒核酸进行体外定性检测。本审评要点适用于进行首次注册申报的产品。

二、性能评估：

企业应提交在符合质量管理体系的生产环境下生产的试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、实验方案、实验数据、统计分析等详细资料。建议着重对以下分析性能进行研究。1.核酸（RNA）提取/纯化性能在进行靶核酸检测前，应有核酸（RNA）提取/纯化步骤。该步骤的目的除最大量分离出目的RNA外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。无论检测试剂是否含有RNA分离/纯化的组分，企业都应结合检测试剂的特性，对配合使用的核酸提取试剂/方法的提取效率、提取核酸纯度等做充分的验证，提供详细的验证资料。2.最低检测限（1）最低检测限的确定将含有2019新型冠状病毒的真实临床样本/含有该病毒RNA片段的假病毒颗粒梯度稀释于（与适用样本一致的）适当基质中，用于进行最低检测限研究，应采用科学的方法标定病毒滴度。每个浓度梯度最少重复三次检测，以100%可检出的最低浓度水平作为估计检测限，在此浓度附近制备若干梯度浓度样品，每个浓度至少重复20次检测，将具有90%～95%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的最低检测限。在进行最低检测限的确定时，应至少包括不同来源的三个具有代表性的2019新型冠状病毒样本，进行系列梯度稀释。（2）最低检测限的验证选择不同来源的至少3个病毒样本（与最低检测限确定不同的病毒样本）在最低检测限浓度水平进行验证，应达到90%～95%阳性检出率。应提供详细的病毒液滴度的确定方法及验证结果。3.不同区域病毒样本包容性的验证至少验证包括具有时间和区域特征性的10个不同来源的病毒样本（阳性临床样本或分离培养物），应包括最低检出限、重复性等性能的验证，病毒样本的滴度应采用科学合理的方法进行标定。4.分析特异性（1）交叉反应验证包括：①地方性人类冠状病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒；H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季节性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C组，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，肠道病毒A、B、C、D组，人间质肺病毒、人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒；肺炎支原体、肺炎衣原体；军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌； 烟曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌等。建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的浓度水平为10⁶cfu/ml或更高，病毒为10⁵pfu/ml或更高，提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。②人类基因组DNA。（2）内源/外源物质干扰应根据所采集样本类型，针对可能存在的干扰情况进行验证。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价，在病毒临界阳性水平进行干扰试验验证。检测的潜在干扰物包括样本中的原有物质（如血液、鼻腔分泌物、粘液及用于缓解淤血、鼻噪、刺激或哮喘和过敏症状的鼻腔和咽喉药物、抗菌药物、抗病毒药物等）及在样本采集和制备期间引入的物质。表1 推荐用于干扰试验的物质

三、注册检验

应提供符合产品技术要求的、在具有相应医疗器械检验资质和承检范围的医疗器械检验机构进行的产品检验报告，应提供连续3个生产批次样品的检验合格报告。该项目已有国家参考品，应使用国家参考品进行注册检验。

四、阳性判断值确定资料

阳性判断值确定资料主要指对申报产品病毒核酸检测的Ct值，即结果判断的临界值进行确认的资料。阳性判断值研究资料样本来源应考虑不同年龄、性别、地域等因素，尽可能考虑样本来源的多样性、代表性。如存在判定值灰区，应提供灰区的确认资料。应说明所选择阳性判断值研究方法的合理性，阈值设置应科学合理。提供内标值的确定方法和研究资料。

五、主要原材料研究资料

此产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分（如有）、质控品、参考品等。应提供主要原材料的选择与来源、制备过程、质量标准等相关研究资料、质控品的定值试验资料等。如主要原材料为企业自制，应提供其详细制备过程；如主要原材料源于外购，应提供资料包括：选择该原材料的依据及对比筛选试验资料、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。1.引物和探针：应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、靶序列的基因位点及两者的对应情况。建议每种病毒设计两套或多套引物、探针以供筛选，通过序列比对和试验等方式，对病毒进行包容性和特异性（如交叉反应）的评价，选择最佳组合，并提交筛选的研究数据。引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、纯度、浓度及功能性实验等。2.脱氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，应提供对其纯度、浓度、功能性等的详细验证资料。3.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆转录酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，应分别对酶活性、功能性等进行评价和验证。4.试剂盒内质控品试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒质控品来实现，其应参与样本处理、核酸的平行提取和检测的全过程。以对整个提取和PCR扩增过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。申报资料应对试剂盒质控品有关原料选择、制备、定值过程、浓度范围等试验资料详细说明。企业应对质控品的检测结果（如Ct值）做出明确的范围要求。4.1阴性质控品应不含试剂盒所检测的靶序列。4.2阳性质控品阳性质控品可用1～2个病毒株为代表，应含有天然的或人工合成的包含试剂盒可检测靶序列（如假病毒）。 5.内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，应与靶核酸一同提取及扩增，申请人应对内对照（内标）的引物、探针设计和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。对内对照的检测结果（如Ct值）亦应做出明确的范围要求。建议科学设置内对照（内标），对待侧样本的取样质量、试剂的反应体系进行监控。6.企业参考品应根据产品性能验证的实际需要自行设定企业内部参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品、重复性参考品。阳性参考品应着重考虑不同来源的病毒样本和滴度要求，应至少选取不同来源的5个病毒样本。阴性参考品则主要涉及对交叉反应的验证情况，建议包括冠状病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠状病毒（可采用假病毒）、MERS冠状病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。检测限参考品的浓度水平可采用90～95%阳性检出水平或略高于最低检测限的水平，如100%阳性检出水平。检测限参考品的浓度确定应科学合理。重复性参考品建议包括高、低两个浓度的样本，其中一个浓度应为最低检出限附近的浓度。申请人应对内部参考品的来源、型别鉴定、病毒滴度等信息进行精确的试验验证，并提交详细的验证资料。

六、主要生产工艺及反应体系的研究资料

1.介绍产品主要生产工艺，可用图表方式表示，并说明主要生产工艺的确定依据。2.反应原理介绍。3.详述样本采集、样本处理方式的选择和设置，提供相关的研究资料。（1）研究样本采集时间点的选择：是否受病程、临床症状、用药情况等因素的影响。（2）研究对采样拭子及样本保存液的要求：对采样拭子的材质要求（包括对拭子头和拭子杆的要求），保存容器要求，裂解液、保存液成分、浓度、使用量的要求等。4.确定最佳反应体系的研究资料，包括样本用量、各种酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。建议在保证核酸提取纯度的情况下尽量扩大总反应体系和加样量。5.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。6.如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。

附表：