化学发光丨最具潜力的免疫学检测方法
来源: 小桔灯网 作者: GZHS 2020年10月07日 11:49
免疫学的检测方法是实验室使用最普遍的检测方法,从凝集试验、胶体金到ELISA,未来随着检测方法朝着高通量和自动化的方向发展,化学发光方法将是大势所趋!

化学发光丨最具潜力的免疫学检测方法


免疫学的检测方法是实验室使用最普遍的检测方法,从凝集试验、胶体金到ELISA,未来随着检测方法朝着高通量和自动化的方向发展,化学发光方法将是大势所趋!
概要:化学发光技术壁垒高的根本原因在于:1)被检测物质的浓度低(μg/L—pg/L ),造成对整个检测系统的精密度要求高,仪器与试剂体系封闭;2)整个检测过程步骤多,自动化难度大;3)包含生物、化学、物理、光学等各个学科的多种前沿技术,缺一不可。
国内外主流的试剂技术类似,主流有直接化学发光(异鲁米诺(新产业)、吖啶酯(雅培))、间接(酶促)化学发光(丹纳赫、迈瑞、安图)、电化学(罗氏),各有优劣势,暂无明显技术替代的趋势,但是电化学发光被认为是第三代技术,技术上略略领先。
试剂的性能包括准确度、灵敏度、线性范围、抗干扰能力、存储稳定性、开瓶稳定性、试剂盒规格等;机器的性能包含检测速度、试剂位、样本位、仪器大小等,准确度是核心,通过与已获证产品的对比得到;其他性能间接影响准确度,需要结合具体项目标准、厂家性能以及客户需求综合评价。
化学发光是干什么的?化学发光临床广泛应用于临床。化学发光是免疫诊断的一种,是利用抗原抗体之间的特异性反应来测定体内疾病标志物浓度,从而判断人体身体状态的诊断方法,广泛应用于传染病、心脏疾病、肿瘤、妊娠检测等。


免疫检测标志物统计超过100个,按照免疫反应中的角色,标志物可以分为抗体与抗原,其中抗原又包括大分子抗原与小分子抗原。


化学发光的原理免疫反应。抗原进入机体,刺激机体的免疫系统,使之产生免疫应答,这种反应叫免疫反应。免疫反应应答包括对抗原物质的感应、反应、效应三个连续的阶段。免疫分析(immunoassay,IA)。在临床检验中,基于抗原与其配对抗体能够发生特异反应,用已知的抗原或抗体检测分析体液中的抗体或抗原性物质。高特异性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度的特异性。抗原抗体反应的高特异性是免疫学检测的基础。高亲和性。抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡,其反应式为:Ag+Ab→Ag·Ab。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合,两者结合牢固,不易解离。
免疫分析技术的发展:美国临床化学会议规定:凡是通过测量光子计数的方法都是化学发光。与酶联免疫相比化学发光的进步点:1.全程自动化——机械与自动化;2.定量技术的优化:利用化学发光发光,精确计算光子数——光学;3.磁性颗粒的应用——材料;4.抗体标记技术的进步——生物化学。

免疫诊断五大方法对比:化学发光是趋势与其他免疫诊断方法相比,化学发光由于其在安全性、自动化操作、测试准确性、以及测试速度等方面的系统性优势,在性能上对其他技术形成全面超越,因此成为免疫诊断的主流。


化学发光步骤繁多。化学发光原理解析:以酶促法(一步法)为例

根据冲洗次数,可以分为一步法、两步法、三步法等、四步法;
各个组分的量在5~200uL级别;所有过程均需要在特定温度中进行;样本中与被检测检测抗原/抗体结构类似的物质会对结果产生较大影响;


磁微粒标记-分离技术

 磁微粒指的是nm级别的磁性颗粒,表面带有活性基团;

磁微粒可以利用表面的活性基团与抗体、抗原、链霉亲和素连接;

伴随着磁微粒技术的发展,板式发光已基本被替代。

 

磁微粒分离技术特点:

•较微孔板扩大抗原抗体结合表面积,增加抗原或抗体的结合量,提高检测灵敏度。

•加快反应速度,迅速捕获抗原抗体。

•易于结合相、游离相的分离,提高检测准确性

酶标记技术、溯源以及试剂盒的开发难点酶标记技术抗体/抗原表面具有多个活化基团(氨基/羧基),通过这些基团连接酶与抗体称为酶标记;酶标记分为大分子与大分子标记、大分子与小分子标记;交联程度的小大对试剂盒性能起重要影响。试剂盒的开发变量多:抗体对的配对、“磁珠”与“酶标”的稀释度、合适的“配方”溶液、其他的试剂盒组分、孵育时间检测结果溯源将开发的试剂盒检测结果与对照结果建立相关的关系标准品的稳定性是难点不同的厂家检测结果的绝对值可能不同

主流的化学发光技术各有千秋化学发光的基本原理:由于化学反应(通常是氧化)底物从基态跃迁为激发态,激发态返回基态时,跃迁能量以光子形式释放的现象。
吖啶酯、ALP以及HRP发光系统的原理电化学发光原理各个系统优劣势比较
主流的5大发光技术各有优缺点 •综合来看,主流的5大发光技术各有优缺点,不能说技术谁优谁劣,但是从市场来看,Roche的电化学发光技术市场认可度稍稍领先;•从国外四大家的优势项目对比来看,Roche(电化学)在肿瘤项目上占优,雅培(吖啶酯)在传染病项目上占优,而丹纳赫(ALP)在甲功激素项目上占优,也可以看出代表各个国外龙头厂家代表的技术无法占据绝对优势;•相对于不同技术种类的差异,国内厂家对产品研发、质量控制能力更为重要。
化学发光试剂的性能评价与比较:•准确度是评价试剂性能的主要指标,一切指标都体现在测试是否准确,但是由于各个标志物均有一定的特异性,客户无法根据某一次结果的正确与否对该厂家的产品做出评价——化学发光的结果只能作为参考,不能作为金标准;•国内厂家结果的准确度根据与国外厂家的对比结果来判断,线性系数R2、显著性水平等是重要的指标;•除了准确度以外,试剂的灵敏度、重复性、线性范围、抗干扰能力、存储稳定性、开机稳定性、试剂盒的包装量等20多个参数均为试剂盒的评价指标。除了仪器与试剂性能的对比,装机量、单机使用量、项目总数量、项目发布、三甲医院使用率等数据对评价厂家的产品同样重要,需要综合评价。
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