分子诊断是应用分子生物学方法，通过检测受检个体或其携带病毒、病原体的遗传 物质的结构或含量的变化而做出诊断的技术。其检测对象主要为核酸和蛋白质，以核 酸分子为主，相比于发展成熟的免疫诊断、生化诊断等技术，分子诊断处于快速成长期，是体外诊断（In Vitro Diagnosis, IVD）领域发展最快的细分领域，具有检测时间 短、灵敏度更高、特异性更强等优势，被广泛应用于传染性疾病、血液筛查、遗传性 疾病、肿瘤伴随诊断等领域。
分子诊断技术的发展经历了四个阶段：
（1）第一阶段：20 世纪 80 年代基于核酸分子杂交技术的遗传病诊断；
（2）第二阶段：20 世纪 90 年代聚合酶链式反应（PCR）的问世将分子诊断技术推 向更精准、更高效的阶段特别是发展到第二代的荧光定量 PCR（qPCR）和第三代的 数字 PCR（dPCR）；
（3）第三阶段是基于基因芯片的多指标、高通量基因检测；
（4）第四阶段是基于基因测序技术在 NIPT（无创产前诊断）、遗传性肿瘤筛查及肿 瘤精准治疗等方面的应用。
国内分子诊断起步较晚，发展速度高于全球。在精准医疗、个性化用药等需求推动下， 分子诊断技术在全球得到飞速发展，根据火石创造数据显示，2013-2019 年全球分子 诊断市场规模由 57 亿美元增长至 113.6 亿美元，年复合增长率为 12.18%，主要市 场玩家包括罗氏、雅培、西门子、强生等。国内分子诊断虽然起步较晚，但在消费升 级、政策扶持以及资本青睐等多重因素推动下，已经由产业导入期步入成长期。2013- 2019 年，我国分子诊断市场规模由 25.4 亿元增长至约 132.1 亿元，年复合增长率达 到 31.63%，虽然仅占全球市场规模的 16.86%，但是增速约为全球增速的 2.6 倍， 主要企业包括达安基因、凯普生物、华大基因、贝瑞基因、艾德生物等。
分子诊断领域主要包括 PCR（qPCR 和 dPCR）、二代测序技术（NGS）、荧光原位 杂交（FISH）、基因芯片等，其中 PCR 是目前应用最成熟、市场份额最大的技术平台，在国内分子诊断中市占率为 40%，在国内获批的分子诊断产品中，基于 PCR 技术的超过 90%。
与杂交技术和测序技术相比，PCR 技术主要优势在于高灵敏度、易 于推广，主要局限在于检测位点单一且已知，多重基因联合检测时可涵盖的基因数量 受限，目前已经发展到第三代数字 PCR（dPCR），短期内仍将是分子诊断主流技术 平台；测序技术发展迅猛，虽然市占率较低但市场增速最快，其中二代测序技术 NGS （高通量测序）是目前测序领域应用最广泛的技术，已经成为许多序列变异分析与科 研应用的主要选择，但由于实验操作复杂、成本高等原因，在临床应用中仍处于起步 阶段，应用前景广阔。
荧光原位杂交技术（FISH）
FISH 是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术，主要用于指 导肿瘤靶向药物使用、肿瘤预后、肿瘤疾病分型诊断等领域，是检测 HER-2 基因状 态的金标准，目前在大多数省份和地区已经纳入医保。
FISH 全称荧光原位杂交技术， 原理是利用已知的 DNA 变异序列，与被检测的样本 DNA 序列杂交、互补配对，从 而发现样本 DNA 的异常情况，主要用于了解基因或染色体是否发生扩增、缺失、融 合或断裂，检测样本来源广泛（组织、脱落细胞、羊水、血液、骨髓等），且不仅限 于新鲜样本，2-3 年的石蜡样本都可以检测；同时，FISH 检测成本较低而且在大多 数省份和地区都被纳入医保范畴。FISH 应用最多的场景是 DNA 扩增检测，《2014 年 NCCN 乳腺癌临床实践指南》和《乳腺癌 HER2 检测指南 2014 版》均指出 FISH 是 检测 HER2 基因状态的“金标准”，目前 Roche、Abbot 等研发的 HER-2 扩增检测 试剂盒已获得 FDA 批准。
基因芯片技术
基因芯片技术又称 DNA 微阵列技术，是将大量已知 DNA 序列做成探针，集成在同 一芯片上与标记样品分子进行杂交，从而获得样本序列信息，可以实现对大量目标 基因同时进行检测，具有成本相对较低（比如微基因的 WeGene检测套件仅 599元）、 检测效率较高的优势，主要应用于消费级基因检测、病毒分型、耐药突变位点检测、 遗传基因和肿瘤基因检测等领域。相比基因芯片产业在发达国家的高速发展，我国基 因芯片行业市场尚处于起步阶段，代表企业包括赛乐奇、博奥生物、百奥科技、达安 基因等，目前获批的基因芯片诊断试剂盒主要应用在 HPV 病毒基因分型、乙肝病毒 基因分型和耐药突变位点检测、肿瘤基因突变等领域，获批的基因芯片相关仪器较 少。在国家相关政策和终端需求不断扩大的推动下，我国基因芯片技术已经进入产业 化探索阶段，根据沙利文数据显示，中国基因芯片行业市场规模从 2014 年的 35 亿 元增长至 2018 年的 95.1 亿元，年复合增长率为 28.4%。
1.2 PCR：分子诊断主流技术平台，临床诊断“金标准”
PCR（聚合酶链式反应）是指利用 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）在体外条件 下，催化一对引物间的特异 DNA 片段合成的基因体外扩增技术。PCR 是生物体外 的特殊 DNA 复制，最大的特点是能将微量的 DNA 大幅扩增。以实时荧光 PCR 技术 为例，通过 PCR 技术进行分子诊断的主要流程包括：
1.核酸的提取和纯化：使用核酸提取试剂从病毒、细菌等中提取出 DNA；
2. 核酸在引物约束下特异性的 PCR 扩增：在提取的 DNA 中加入扩增需要的反应 液（酶、复制需要的原料、引物等），在 PCR 仪中完成扩增过程；
3. 扩增产物的检测：通过荧光标记法检测 DNA 含量，从而判断病毒 DNA 含量，给 出诊断结果。
PCR 技术最大的特点就是灵敏度高、特异性好、及时方便，在基础研究以及医学诊 断、法医学和农业科学等各大领域应用广泛。在临床诊断中，PCR 技术具有诸多优 势：灵敏度高，靶细胞检出率可达 1/100 万，病毒检测灵敏度≥3RFU，最小细菌检 出率为 3 个，检测样本纯度要低，仅需 DNA 粗提取；扩增反应在 2-4 小时内完成， 使用简便、快捷。作为临床诊断的“金标准”技术，PCR 广泛应用于血站核酸检测、 疾控核酸检测、临床核酸检测等领域，其中，在传染病诊断和血筛检测中，PCR 技 术能缩短诊断的“窗口期”并且可以定量对病原体进行检测，相比于传统的免疫诊断 方式，具有不可替代的优势，基于 PCR 技术的分子诊断是医院对传染病诊断的“金 标准”。
PCR 经过三代技术更迭，精确度和灵敏度不断提高。PCR 技术最早由穆勒于 1985 年发明，经历了第一代定性 PCR、第二代定量 PCR 和数字 PCR 三代技术迭代，其 中第二代定量 PCR 包括荧光定量 PCR（qPCR）以及在其基础上分化出来的 ARMS （突变扩增阻滞系统）和 HRM（高分辨溶解曲线）。三代技术的主要差异如下：
Ø 第一代定性 PCR 技术：采用琼脂糖凝胶电泳对 PCR 扩增产物进行分析，存在 交叉污染、检测耗时长、只能做定性检测等缺点，目前处于衰退期，已基本被淘 汰；
Ø 第二代荧光定量 PCR（qPCR）技术：qPCR 在一代定量 PCR 的基础上引入荧光探针标记法从而实现定量检测，目前发展最成熟、应用最广泛、临床普及率高， 为现阶段主流应用平台，正处于从成长期向成熟期过渡的阶段，市场增速在 20% 以上；
Ø 第三代数字 PCR（dPCR）技术：dPCR 是在 PCR 原理的基础上利用芯片和荧 光检测技术进行核酸绝对定量检测。芯片技术是 dPCR 的核心工艺，利用对样 品进行分液处理进而实现“单分子模板 PCR 扩增”，达到定量检测的目的，具 有更高的精确度和灵敏度，目前处于导入期，市场增速在 10%-15%。
二代 PCR：主流分子诊断平台，伴随诊断和感染性疾病领域为主
qPCR（荧光定量 PCR）是目前应用最成熟、临床应用最广泛的技术平台。qPCR 在 国内外均为分子诊断临床应用最广泛的技术平台，尤其是在感染性疾病（病毒性肝 炎、性病和其他病菌/病毒类等）和肿瘤伴随诊断领域，目前仍以 qPCR 技术平台为 主。据不完全统计，截至 2020 年 5 月 11 日，国家药监局共批准了 806 个 PCR 类 产品，其中荧光定量 PCR（qPCR）产品占比高达 85.11%。在伴随诊断领域，NMPA 获批的伴随诊断产品中有 60%都是基于 qPCR 技术，而 FDA 批准的 39 个伴随诊断 产品基于 qPCR 技术的产品占比也高达 38.46%（15 个）。
国内 PCR 行业竞争激烈，不同细分领域龙头效应显著。二代 PCR 技术门槛相对较 低，国内获批的 PCR 检测产品数量多、竞争激烈，主要企业包括达安基因、艾德生 物、凯普生物、之江生物、硕世生物、透景生物、圣湘生物等。
从获批的 PCR 检测试剂盒数量维度看，达安基因拥有 38 种基于 qPCR 技术的检测试剂盒取得 NMPA 的批文；从不同细分应用领域维度看，各家产品线重合度较高，尤其是优生优育、性 传播疾病、HPV 检测等领域竞争激烈，但艾德生物、凯普生物、亚能生物凭借多年 在不同细分领域的先发优势、技术积累以及渠道优势等分别在伴随诊断、HPV 检测、 地中海贫血检测领域处于绝对领先地位，其中凯普生物在 HPV 检测领域占据 1/3 市 场份额，艾德生物在 PCR 伴随诊断领域具有绝对领先优势。
第三代数字 PCR（dPCR）：应用前景广阔，未来发展趋势
和 qPCR 相比，dPCR 优势包括：灵敏度高（可以达到单个核酸分子）、无需标准曲 线或参照基因进行对比来测量核酸量、适合环境复杂样品的检测、能够有效区分浓 度差异微小的样品。dPCR 在国内尚处于起步阶段，目前仅有南京科维思生物的 HER2 基因扩增检测试剂盒（数字 PCR 法）获批，在肿瘤伴随诊断、肿瘤早筛、传 染病检测、NIPT、药物基因组学等领域具有较大临床应用潜力和优势。根据沙利文 数据显示，中国 dPCR 行业市场规模从 2013 年的 14.6 亿元增加至 2017 年的 72 亿 元，CAGR=29.2%，到 2022 年市场规模预计将达到 266.6 亿元。
1.3 高通量测序（NGS）：引领分子诊断走向高端，应用前景广阔
测序技术更迭速度快，二代高通量测序（NGS）为市场商用主流。从 1977 年第一代 DNA 测序技术（Sanger 法）发展至今，测序技术经历了第二代高通量测序（NGS）、 第三代单分子测序技术和第四代纳米孔测序技术的发展变革，各代技术应用领域不 尽相同，各有优缺点，目前处于三代技术并存的局面。第一代 Sanger 测序技术具有 测序读长较长、准确率高的优点，但由于通量低、成本高等因素没有得到大规模应用；二代测序技术自 2005 年以来快速发展，凭借高通量、低成本、测序时间端等优势， 在全球测序市场中仍占据主导地位；第三/四代技术在测序流程、测序时间和读长上 进一步优化，在 ctDNA 测序、单细胞测序等也具有明显优势，是未来发展趋势，但 目前由于错误率较高、分析软件不够丰富等原因，商用受到一定限制，未来随着技术 的改善有望进入成熟应用阶段。
高通量测序技术（NGS）又称为下一代测序技术，是指通过模板 DNA 分子的化学 修饰，将其锚定在纳米孔或微载体芯片上，利用碱基互补配对原理，在 DNA 聚合 酶链反应或 DNA 连接酶反应过程中，通过采集荧光标记信号或化学反应信号，实 现碱基序列的解读，一次性可完成几十万至上百万条序列的测定。NGS 技术可提供 满足评估目标靶向基因所需的扩展性、速度和分辨率。可以同时对许多样本中的多个 基因进行评估，如此便可运行多个独立的分析，从而节省时间并降低成本。另外，与 范围更广的方法（如全基因组测序）相比，靶向基因测序生成的数据量更少，更易管 理，因而分析起来更加轻松。
文章来源：摘自未来智库《分子诊断行业深度研究及投资策略：精准医疗，看PCR还是NGS》，如涉及侵权，请联系删除。
