近年来，造成人类感染性疾病的病原微生物日益复杂、种类增多，抗菌药物滥用致使细菌耐药，病原微生物已成为全球关注的焦点。
感染是急危重症患者死亡的主要原因之一。据 WHO 统计，全球感染性疾病导致的患者死亡占全部死因的 25%以上，每年约 1300 万儿童死于感染性疾病。在中国，感染性疾病占所有疾病的 50%以上，75%造血系统肿瘤患者和 50%实体肿瘤患者死于感染，脓毒症（严重感染）患者病死率高达 50%。重症感染起病急、进展快、病原体复杂，基于宏基因组的二代测序（ metagenomics nextgeneration sequencing，mNGS）技术作为病原微生物的快速检测手段， 在重症和疑难病例的病原学诊断中发挥了重要作用。
微生物鉴定方法比较
传统的微生物鉴定方法分为培养和非培养两类。临床公认的“金标准”是分离培养和生化鉴定，这种方法的操作周期长、失败率高，并且不是每种病原体都可以培养。
不依赖培养的方法，比如涂片镜检、抗体抗原免疫等，在采样当天即可报告结果，这些方法的时效性强，但在敏感性和特异性上存在较明显的劣势，而且传统的微生物鉴定方法无法快速识别未知或者罕见的病原微生物。
PCR检测虽然在灵敏度、特异度和检测时效上明显优于培养法，但因为PCR法基于已知病原菌的基因组序列，所能提供的信息有限，依然不能解决临床诊断阳性率低的问题。
质谱技术因其高灵敏度、特异性、自动化和高通量等特点，被广泛用于病原微生物蛋白质、多肽等的研究。但目前仅能处理培养后菌株等相对单纯样品，难以对原始临床标本中复杂背景样品进行病原检测，检测内容也仅限于病原体分型，在生物耐药性分析和毒力研究等方面进展较少。
mNGS 不依赖于传统的微生物培养，也无需特异性扩增，可直接对临床样本中的核酸无差别、无选择性地进行高通量测序，与已知微生物序列数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫）。
|
检测方法
|
优点
|
缺点
|
|
培养法
|
临床公认的“金标准”，可适应较大样本体积、价格低廉
|
检测敏感度受限于培养时抗生素的使用、有些微生物难以培养、无法检测病毒、检测周期长
|
|
免疫学法
|
时效性强，周期1-3天、价格便宜、操作简单、可检测支原体、衣原体、病毒等
|
敏感性和特异性差、并不是所有病原微生物都有相应抗体、有窗口期、假阳性高
|
|
核酸检测（PCR）
|
简单、快速、价格低、可定量检测、准确性高
|
依赖主观假设、检测已知的微生物、需要引物扩增，但引物并不总是可靠、只能检测微生物基因组的很小部分
|
|
质谱法
|
过程简单、特异性和准确性高、可进行高通量分析
|
基于已培养的阳性菌落，依赖培养、只能检测细菌和真菌约1000种已知微生物、部分病原体不能鉴定到种、只能定性不能定量
|
|
mNGS
|
客观检测，不依赖假设、可检测任意微生物、可以发现新的病原微生物、可定量检测核酸、可检测基因组的任一部分
|
检测结果受宿主背景微生物组成影响、对样本要求高，易受其他部位样本污染，易受环境微生物污染，时效性不如核酸检测PCR、检测价格高
|
mNGS流程及存在的问题
病原微生物高通量检测过程主要包括实验操作（湿实验）和生信分析（干实验）两个部分。湿实验从收到标本开始，针对不同的样本类型进行特异处理，提取核酸进行文库构建，然后上机测序；干实验包括下机数据的分析，去人源宿主序列，比对病原微生物数据库，进行种属鉴定，最后解读报告。
宏基因组病原体微生物检测流程
虽然mNGS对罕见病原菌感染的诊断具有优势，可审慎地用于现有成熟检测技术不能确定的病原体，或经恰当与规范抗感染治疗无效的患者。但其技术仍存在着一些尚待解决的问题：
1、操作流程标准化：mNGS操作流程复杂，各个环节均易引入污染，干扰检测结果，所以在防止污染和质量控制方面建立一系列标准化操作程序必不可少。
2、定植菌、背景菌易干扰：检出的病原体只能代表标本中存在这些检出微生物，无法具体确定是定植菌、背景菌还是致病菌。
3、胞内菌/厚壁菌检出率低：胞内感染菌释放到体液中的含量较少，具有较厚细胞壁的病原微生物（如真菌）的核酸提取效率较低，可能因检出序列数少、微生物丰度低，在检测报告中未被列举。
4、RNA 检测难度大：人源 RNA 的丰度和复杂度较高，且易降解，对样本运输和保存有更高的要求。
5、尚不能完全指导耐药菌用药：目前报道的耐药基因型与耐药表型的关联程度还存在一定差距；应用 mNGS 对临床样本进行耐药相关基因的分析需要极高的测序深度，成本将增加数千倍。
应用场景
mNGS作为新兴的病原体检测技术在感染性疾病诊断中的优势及应用价值无需置疑。如何在当前微生物检验流程中找到适合的切入点是 mNGS 向产业化转变的关键。
样本类型——病原微生物检测通常是对病人感染部位取样检查，判断菌种。常用微生物检查标本有血液、尿、痰、胸水、腹水、各种分泌物、各种穿刺液、灌洗液以及鼻咽/口咽拭子等。
适用人群——目前，mNGS 的临床适用人群定位主要以急危重症感染患者为主，其主要适应证包括：
①病情危重需要尽快明确病原体；
②特殊病人，如免疫抑制宿主、合并基础疾病、反复住院的重症感染患者，需要尽快明确病原体；
③传统微生物检测结果反复阴性且治疗效果不佳；
④疑似新发病原体、临床上提示可能有一定的传染性；
⑤疑似特殊病原体感染；
⑥长期发热和/或伴有其他临床症状、病因不明的感染。
感染领域——mNGS技术在血流感染、中枢神经感染、呼吸道感染、不明原因发热及肺炎等多领域已得到临床医生认可和尝试使用。
血流感染：外周血作为血流感染首选的检测样本，mNGS可显著提高血流感染的精准诊断效率，缩短了病原诊断时间，促进抗菌药物的合理应用。
中枢神经系统感染：mNGS在中枢神经系统细菌性感染方面比传统检测方法具有更高的检出率，且受抗菌药物影响更小，但不能取代细菌培养等传统检测方法。此外，mNGS在诊断中枢神经系统结核、病毒、特殊病原体（如布鲁氏菌）、寄生虫等病原体感染方面也具有不可替代的优势，而在隐球菌和曲霉等真菌性病原体的检测需与传统检测方法结合。mNGS检测也有助于非感染性疾病如自身免疫性脑炎的鉴别诊断，帮助指导用药。总体来说，mNGS可作为慢性和复发性中枢神经系统感染的一线诊断方法，急性脑炎病例的二线诊断方法，推荐将mNGS与常规微生物检测手段结合使用。
呼吸道感染：mNGS可对呼吸道感染提供快速、精准的病原检测和鉴定，有效指导抗菌药物的合理应用，避免滥用。mNSG对苛养菌（如结核/非结核分枝杆菌、诺卡菌、放线菌、厌氧菌等）、病毒等的检测灵敏度优于或不劣于传统检测方法。总体来说，mNGS检测的灵敏度在不同的呼吸道样本中差异不显著，但是针对非结核分枝杆菌的检测，肺泡灌洗液的检测灵敏度要优于痰液样本。此外，mNGS在肺部混合性感染的诊断效率优于传统检测方法。
骨和关节感染：针对骨和关节感染的患者，滑膜液、植入物的超声清洗液以及假体周围的组织都可以用作mNGS检测的标本。尤其推荐微生物培养结果为阴性、经验性抗菌药物治疗效果不佳以及清创效果差的患者使用mNGS进行病原检测。
尿路感染：mNGS在细菌、真菌性尿路感染方面并不优于传统检测方法，对于病毒性（如肾移植后多瘤病毒）感染、复杂性尿路感染诊断方面具有优势。此外，尿液检测中的限制点在于报告解读难度大，远端尿道、尿道周围皮肤以及阴道定植菌会干扰报告判读，需要有经验的临床医生参与解读。
消化系统感染：mNGS在肠道病原鉴定中的应用较少，其更大的应用价值体现在肠道病原微生物中耐药基因鉴定，以及识别罕见病毒性肝炎的原因。
复杂和非典型病原体感染：许多病例已经证明了mNGS在鉴定复杂和非典型病原体感染方面的优越性。
免疫功能低下患者：推荐mNGS作为实体器官移植和造血干细胞移植患者的一线感染诊断、监测工具或作为常规检测的补充手段。
不明原因发热患者：mNGS已经极大提高了不明原因发热患者的病原诊断效率，并有望用作发热待查患者的一体化诊断测试，用于区分感染和非感染，以及发现新发病原体。
不明原因肺炎：新型冠状病毒最初由mNGS技术鉴定出，该技术对于监测和应对突发传染性疾病具有重要价值。
新冠助推mNGS乘风破浪
2019年12月末，湖北武汉金银潭医院5例重症肺炎患者的临床资料和支气管肺泡灌洗样本，进行mNGS检测，发现从未报告过的、与SARS病毒核苷酸序列相似度达79%的冠状病毒。证明了mNGS在突发传染病检测中的重要价值。
国内已有多家提供mGNS微生物检测服务的公司，包括华大基因、赛哲生物、金匙基因、谱元科技、杰毅生物、博奥生物、达瑞生物、永诺生物、微远基因、迅敏康、微码、锐翌生物等。疫情的助推，促使各家企业在今年纷纷拿到亿元级别的融资。
2020 mNGS企业融资情况
|
企业名称
|
融资时间
|
融资轮次
|
融资金额
|
投资机构
|
|
华大因源
|
2020-06-22
|
股权融资
|
4000万人民币
|
高林资本
南海领航
华大基因
|
|
微远基因
|
2020-08-12
|
B轮
|
2亿人民币
|
鼎晖投资
中金资本
火山石资本
国科嘉和
|
|
杰毅生物
|
2020-08-01
2020-03-17
|
A轮
Pre-A轮
|
千万级人民币
近亿人民币
|
辰德资本
比邻星创投
普华资本
个人投资者
|
|
予果生物
|
2020-09-28
2020-06-29
2020-02-25
|
A轮
Pre-A+轮
Pre-A轮
|
2.18亿人民币
千万级人民币
近亿人民币
|
龙磐投资
创新工场
辰德资本
北极光创投
真善美嘉通投资
北极光创投
|
|
迅敏康
|
2020-04-27
|
A轮
|
数千万人民币
|
翕然资本
泛洲麒翔
|
|
金匙医学
|
2020-11-02
2020-02-03
|
C轮
B+轮
|
2.3亿人民币
5000万人民币
|
华盖资本
杏泽资本
元生创投
君联资本
帆茂投资
达晨财智
君联资本
|
|
锐翌生物
|
2020-02-29
|
战略融资
|
未披露
|
张江浩成
鲁信创投
|
在竞争中脱颖而出的根本是取决于测序结果的可靠程度，不同的公司采用不同的样本处理技术、数据库及数据分析技术，报告解读方法各有差异，无统一标准，临床医生需凭借经验进行解读。
微生物检测服务公司如何协助临床医生进行数据解读，提高诊断准确度也是目前差异化竞争的核心。“探因医学”是专注于病原微生物临床分子诊断产品研发和mNGS测序服务的高科技企业，业务范围覆盖全国20余个区域，已与200余家三甲医院开展合作。
参考文献：
[1] 病原微生物宏基因组测序，千麦医疗
[2] 宏基因组分析和诊断技术概述，中国医药报
[3] 肺泡灌洗液宏基因组测序在儿童重症肺炎支原体肺炎混合感染中的诊断价值，临床儿科杂志
[4] 质谱技术在病原微生物诊断中的应用, 中国人兽共患病学报
[5] 一文看懂病原微生物检测, 生信阿拉丁
[6] 超多重PCR技术及其在临床病原微生物检测的应用，探针资本
[7] High‐Throughput Metagenomics for Identification of Pathogens in the Clinical Settings，Small Methods（探因医学）
